《新超级马里奥兄弟U》具有多人合作模式，玩家可以与其他玩家一起合作或竞争，共同完成关卡或进行比赛。此外，游戏还引入了新的玩法要素，例如飞行松鼠角色Nabbit和玩家的Mii形象的加入，为游戏增添了更多的乐趣和变化。
游戏提供了多个关卡，每个关卡都充满了各种挑战和谜题。玩家需要控制马里奥或路易，跳跃、奔跑、收集金币和各种道具，同时要避开敌人和陷阱，到达关卡的终点。游戏中还有一些隐藏的道路和秘密区域，玩家可以探索和发现。
游戏以传统的2D横向卷轴方式呈现，玩家将扮演马里奥和他的兄弟路易，展开一系列冒险。游戏的故事发生在蘑菇王国，邪恶的魔法师Bowser再次绑架了公主Peach，并占领了蘑菇王国的城堡。马里奥和路易必须踏上冒险之旅，拯救公主，夺回被占领的领地。
剧情模式
《新马U》的剧情模式共包含164个关卡，历代之最。其中分别操控马里奥和路易吉的“新马U”模式和“新路U”模式各占82关，虽两个模式共用场景地图和关卡主题，但内容不同。“新马U”是WiiU版的本篇内容，难度适中，且有较丰富的探索内容。
WiiU版DLC“新路U”有较硬核的难度，要求玩家在100秒的时间内到达终点（关卡流程缩短），且关卡内的障碍和敌人也较棘手。
当然就和当下许多游戏一样，本作也并不是只有一种游戏模式。在常规的故事模式中，玩家依然要去拯救总是被劫走的碧奇公主，所以在该模式下玩家按照原来的步调来体验游戏的乐趣就好了，不过，故事模式却逆转了以往的游戏顺序，把最后的W8放在了被黑暗与岩浆所笼罩的碧琪城堡。不过除此之外，制作组还为大家准备了三种玩法不同的游戏模式。这几种模式的加入，无疑让游戏的耐玩性进一步增加了。
Boost Rush模式
该模式支持2到5名玩家同时游戏，需要他们尽可能快速的通关各个场景。该模式下卷轴将会强制移动，迫使玩家快速前进。而且玩家收集的金币越多，卷轴滚动的速度也就越快。完成一次游戏后玩家还可以观看录像，通过观察别人的行走路线和行动方式来获得提示，以帮助自己在下次游戏时能够更快完成。
挑战模式
该模式将提供一系列充满马里奥元素及趣味性的单人和多人挑战，通过竞争的方式来展开。这些挑战非常具有耐玩性，玩家可以不断尝试以获得更高的得分，解锁新的挑战项目。
Boost 模式
该模式将挑战玩家的团队精神，玩家们需要不断磨合、好好合作，这样才能更有效的通过Boost模式。使用GamePad进行互动，实时应对敌人和各种目标物，并寻找最新最快的路线以快速通过每个关卡。而完游戏后玩家可以观看录像，为下一次的挑战做好规划。
