从雷顿教授的恩师受到一封信，信内写著有关一个打开的人必定死亡的传说秘宝“恶魔之箱（悪魔の箱）”。担心的雷顿教授带同路克找寻师傅，但到达后发现师傅遭人杀害。二人为了解开谜题，而乘搭摩伦特利快车。
雷顿教授（声：大泉洋）
本名为艾尔夏鲁?雷顿，有名的考古学家及不思议研究专家。
少年路克（声：堀北真希）
雷顿教授的助手，拥有与动物说话的能力。
阿罗玛（声：能登麻美子）
前作不思议城镇大富豪的女儿，现与雷顿与路克同住。偷偷跟随雷顿与路克乘搭同一列车。
安德鲁?施若德博士
雷顿教授的恩师亦是考古学家，在“恶魔之箱”的研究中被人杀害。
安德森（声：大泽隆夫）
谜一般的青年，传闻他的真正身份是吸血鬼。
卡蒂雅（声：大后寿寿花）
雷顿教授在列车中相识的少女，好像正在旅行。
萨姆（声：安田显）
摩伦特利快车的车长，穿着不合时代的摇滚服装。
罗斯夫人（声：Salyu）
肥胖身形的富有夫人，常炫耀身上值钱的宝石。
哈姆（声：柳原哲也）
肥胖身形的黄金鼠。与雷顿共同行动，希望减肥成瘦长的黄金鼠为目标。
克洛伊（声：平井善之）
在安东尼的怪城堡工作的管家。
神秘婆婆
与前作同样。帮助雷顿收集错过时机的谜题的神秘老婆婆。
在游戏中的所有音乐均收录在专辑《Layton Kyouju to Akuma no Hako Original Soundtrack》（雷顿先生恶魔之箱原声带）中，该专辑仅在日本发售。由Salyu演唱的游戏片尾曲《Iris》，并未在该专辑中出现，有传闻该去的器乐版本在游戏国际版中也被省略，原因是直到这款游戏在海外发布都未能创作完成。与前作一样，本作的音乐亦深受欧洲音乐风格的影响，所演奏的乐器，似乎西班牙音乐影响，比如经常会使用手风琴和小提琴，主旋律有探戈的元素包含在其中，总而言之，游戏中的音乐普遍略带忧伤和忧郁情感。但片尾曲在保留忧伤情感的前提下，却给轻快的情感留有一定的空间，以这种方式结束游戏，标志这个故事并未不如最终的结局。
