本游戏是N64经典3D动作游戏《超级马里奥64》的重制版，不同于N64版中玩家只能操作马里奥，本次的《超级玛丽64 DS》版中将有马里奥、路易、瓦里奥与耀西等四名角色可供玩家选择，每位角色都有各自的特殊能力。除了角色增多之外，游戏的内容也大幅的增加，新增了许多关卡。
《超级马里奥 64 DS》是任天堂在任天堂DS发行的一款经典动作游戏《超级马里奥64》的复刻版。《超级马里奥64DS》是N64版的移植版，更是容纳了36款精品迷你游戏，全部为触摸操作。这些游戏为未来的手机触摸游戏奠定革命性基础，与NDS《触摸瓦里奥》共同成为触摸游戏的创意先驱。
《超级马里奥64 DS》游戏是以N64的经典3D动作游戏为基础所制作，不同于N64版中玩家仅能操作马里奥，《超级马里奥64 DS》游戏中将有马里奥、路易基、瓦里奥与耀西这四个角色可供玩家选择(初期只能使用耀西，其他角色需解救)。除了角色增多之外，游戏的内容也大幅的增加，新增了许多关卡，能源之星的数目也增加到150颗。游戏利用NDS(IDS)的无线网络功能来提供各种多人游玩模式，而且通过Download Play,多人模式只需要一个游戏卡带就可以使多人一同游玩。
“到城堡来，我特意为你烤了一个大蛋糕。”应桃花公主之邀，马力欧与路易吉，瓦力欧来到了蘑菇城堡。但是因为等了很久也不见他们三个出来，耀西决定进城堡一探究竟。进了城堡里面，耀西才发现里面空无一人。
酷霸王偷走了守护城堡的力量之星并把桃花公主关进了墙上的画中。也许，马力欧和他的朋友们也被关进了画中。
为了拯救桃花公主和马力欧他们，耀西也跃入了墙上的画中。
超级马里奥64 DS的操作方法有三种：标准模式、点触模式、双手模式。
Y，加速跑，在山坡等地形需要不断地加速冲才可通过
B，最直白的跳跃，依照各角色的能力效果各不相同，加速配合跳将能达到更好的效果
A，最直接的攻击，对于耀西来说则是用舌头吞吐
R，下蹲，虽然单独用的机会不多，但配合跳跃使用的话能衍生其他技能
下压，B+R，跳起后在空中按R，最常用的破坏技，用于破坏正下方的物体，效果依照各角色的力量来决定，耀西不具备，瓦里奥的最强
后空翻，R+B，先按住R呈下蹲状再跳跃，高度强于普通跳跃
三段跳，B、B、方向+B，在第一次跳跃快落地时按跳能使出二段跳，若在此快落地时再配合方向键按B则可使出三倍高度的三段跳
折返跳：正方向+Y再接着反方向+B
长跳：方向键+R+B
踢腿：A+A+A(耀西不能)
跳踢:B+A(耀西不能)
拿举物体：A(耀西不能)
抛掷物体：A(耀西不能)
爬行前进：R+方向键
贴墙前进：同时按住面朝着墙的方向和前进方向
滑行攻击：在加速跑过程中按A(耀西不能)
滑踢：在加速跑过程中按方向键+R+A
扫膛腿：按住R的时候再按A
攀爬：面向杆子按A
倒立：在杆子顶端按上键
可以支持最大四人无线联机的模式，可以在此与朋友们共享对战冒险之乐。
游戏最主要的模式，以威力星来定义各关卡及任务，并以取得各关卡的威力星作为目标，在原N64版本的基础上增至150颗，全部15个场景世界的120颗基本关卡威力星和30颗隐藏关卡威力星，另游戏内容更加地丰富。
通过在冒险模式游戏过程中各角色抓到兔子来相继开启的Mini游戏，初期设定为8款，全部共36款游戏，作为在NDS版中独增的模式，其耐玩度和游戏趣味不压于冒险模式的主游戏。
